蛋白質(zhì)濃度測定是用于計算純化方法的回收率的重要方法。常用的測定方法包括雙縮脲法、Lowry法、紫外吸收法、BCA蛋白濃度檢測法等。其中常用的方法就是BCA法。BCA 全稱是Bicinchoninic Acid Assay， 也叫Smith Assay，這個方法是由Paul K. Smith 發(fā)明的。這個方法通過展示不同濃度樣品的顏色變化來判斷蛋白的濃度。

檢測原理

BCA是一種堿性的水溶性復合物，性質(zhì)穩(wěn)定。在其提供的堿性環(huán)境下，蛋白質(zhì)可以將BCA試劑中的Cu2+還原為Cu+，Cu+繼而與BCA試劑螯合，從而產(chǎn)生藍紫色的絡合物，在562nm波長處具有強吸收峰，通過測定吸光度，結合標準曲線即可得知蛋白濃度。BCA法因抗干擾性強、簡便準確，靈敏度高而得到廣泛應用，但其也易受溫度、孵育時間的影響。

實驗步驟

一、配制標準品和工作液

1. 配制 BSA 標準品體系（線性范圍 20-2000 μg/mL 或者 5-250μg /mL 標準品制備各 2 種配置方法，請根據(jù)習慣選用恰當方式）。【注】：BSA 標準品濃度為 2 mg/mL，稀釋液為蛋白樣品的溶解液，原則上蛋

白樣品在什么溶液中，標準品也宜用什么溶液稀釋。但也可用水或 1 X PBS 進行稀釋。BSA 標準品體系配制表（配制后可放置于 4℃ 冰箱多次使用）

2. 配制 BCA 工作液

① 計算所需要的總 BCA 工作液體積。總 BCA 工作液體積=（標準品數(shù)量+待測樣品數(shù)量）x 重復數(shù) x 每個

樣品所需要的 BCA 工作液。【注】：試管法檢測時每個樣品加 2.0 mL BCA 工作液，微孔板檢測每個

樣品加 200 μL BCA 工作液。

② 配制 BCA 工作液：50 體積的 BCA 試劑 A 中加入 1 體積的 BCA 試劑 B（A:B=50:1），充分混勻。【注】：BCA 工作液裝入密封容器內(nèi)，室溫條件 24h 穩(wěn)定。

二、檢測方法

1. 試管檢測方法（樣品:BCA工作液=1:20）

2.微孔板檢測方法（樣品: BCA 工作液=1:20）

① 各取 10 μL 標準品和待測樣品加入到微孔板中。【注】：樣品與工作液比例為 1:20，檢測范圍為 125-2000μg/mL。若樣品濃度非常低，可使用 25μL 標準品和待檢測樣品進行檢測（即 1:8），這時試劑盒的檢

測范圍為 20-2000 μg/mL。

② 每孔加入 200 μL BCA 工作液，槍頭吹打充分混勻。蓋上微孔板，37℃ 孵育 30 min。

③ 冷卻到室溫，在酶標儀上的 562 nm 波長范圍處檢測吸光度。

④ 根據(jù) BSA 標準品的吸光度（減去標準品中空白孔的 OD 值即最終的讀數(shù)），繪制標準曲線（ X-蛋白濃

度μg/mL；Y-最終的 OD 562nm）。依據(jù)標準曲線和樣品的稀釋倍數(shù)計算樣品蛋白濃度。

注意事項

在進行BCA法檢測蛋白濃度的實驗過程中，精確性和可靠性是至關重要的。以下是一些關鍵的操作要點和在實驗過程中可能遇到的常見問題及其解決策略：

? 試劑的準備和存儲：確保所有試劑在使用前充分混合且在推薦的溫度下存儲。試劑的新鮮度對實驗結果有顯著影響，過期或不當存儲的試劑可能導致不準確的結果。

? 操作順序的嚴格遵守：在進行BCA實驗時，嚴格按照試劑添加順序和操作步驟進行，避免任何步驟的顛倒或省略。這些步驟設計的順序是為了提高反應效率和結果的一致性。